飽和流出式固相萃取法測定逍遙丸中芍藥苷的含量

摘要：目的采用飽和流出式固相萃取儀（SPEHPLC）法制備逍遙丸供試品溶液，用液相色譜法測定其中芍藥苷的含量。方法ZorbaxSBC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈水（20∶80）為流動相，流速為1 ml/min，檢測波長為230 nm。結果芍藥苷的測定在0.123 2～1.232 μg范圍內線性關系良好，r＝0.999 9，平均回收率為99.16%，RSD為1.6%。結論該方法簡便快速、靈敏度高、有效除去藥物基質保護色譜柱，可用于逍遙丸中芍藥苷的含量測定。

　　關鍵詞：逍遙丸； 芍藥苷；  固相萃取裝置； 液相色譜法

　　Content Determination of Peoniflorin in XiaoYao Pill bySaturated Flowthrough SPEHPLC

　　Abstract：ObjectiveTo develop saturated flowthrough SPEHPLCmethod for the assay of Peoniflorin in XiaoYao pill.MethodsSeparation was performed on a ZorbaxSBC18 column（4.6 mm×250mm，5 μm）．The phase consisted ofacetonitrile-water（20∶80，v/v）．The flow rate was 1 ml/min．The UVdetection was set at 230 nm. ResultsPeoniflorin had a good linearrelationship in the range of 0.123 2～1.232 μg，the average recoveryof XiaoYao pill was 99.16% and the RSD was 1.6%. Conclusion Themethod is simple ，sensitive and rapid ，and reduce the damage ofbase material to the chromatographic column ,it can be applied tothe determination of peoniflorin in XiaoYao Pill．

　　Key words：XiaoYao Pill;   Peoniflorin;  SPE;   HPLC

　　逍遙丸（水丸）是由柴胡、當歸、白芍、白術、茯苓、炙甘草、薄荷七味中藥細粉與生姜煎液混合后制成的水丸，具有舒肝健脾、養血調經之功效，適用于肝郁脾虛所致的郁悶不舒、胸脅脹痛、頭暈目眩、食欲減退、月經不調等癥［1］。液相色譜法具有專屬性強、精密度高等優點，但對供試品溶液的凈化要求高，本品為藥粉直接入藥，大量的基質會損傷色譜柱。飽和流出式固相萃取中藥樣品凈化法具有簡便快速、待測成分損失少、重現性好和能有效保護色譜柱等優點［2］，本文報道應用這種前處理方法制備供試品溶液，建立的逍遙丸中芍藥苷含量的液相色譜測定法。現將結果報道如下。

　　1  儀器與試藥

　　1.1 儀器美國Waters600液相色譜儀、Waters600E四元泵、717自動進樣器、2487紫外可見光譜檢測器、在線脫氣裝置、Empower色譜工作站、Agilent公司ZorbaxSBC18柱、固相萃取小柱（自制）,德國SartoriusBP221S（萬分之一）、BT25S（十萬分之一）電子天平。

　　1.2  試藥逍遙丸（水丸，廣州敬修堂藥業股份有限公司，批號：C11018），芍藥苷對照品（中國藥品生物制品檢定所提供，110736200423），氧化鋁（上海五四化學試劑廠100200目），乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

　　2  方法與結果

　　2.1  色譜條件［3］色譜柱：Agilent：ZorbaxSBC18柱（4.6 mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈水（20∶80）；流速：1 ml/min；檢測波長230nm；柱溫30℃，進樣量5μl。在上述色譜條件下，芍藥苷的保留時間為6.09 min。結果見圖1。

　　2.2  對照品溶液的制備精密稱取五氧化二磷干燥至恒重的芍藥苷對照品1.85 mg，置10ml容量瓶中，加稀乙醇溶解，并稀釋至刻度為儲備液。精密移取儲備液5 ml置25 ml容量瓶中，再精密加入10ml稀乙醇稀釋，搖勻，即得質量濃度61.6 μg/ml的對照品溶液。

　　2.3  供試品溶液的制備取大小適中的空心注射針桶，底部置一塞板，加入5.0g中性氧化鋁，即得自制的固相萃取小柱［4］，加樣前小柱用3倍柱體積的水預洗進行活化。取逍遙丸適量，研細，取約0.8g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲提取（功率250W，頻率33kHz）40min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，續濾液經上述小柱，流出速度控制在0.4～0.6ml/min，收集第8～10 ml流出液作為供試品溶液。

　　2.4  標準曲線的制備用自動進樣器分別吸取對照品溶液2，4，5，10，15，20μl進樣，按上述色譜條件測定峰面積，以進樣質量（μg）對峰面積（A）進行線性回歸，求得回歸方程：Y=79 546X－37610，r＝0.999 9，表明芍藥苷在0.123 2～1.232 μg范圍內呈良好的線性關系。

　　2.5  精密度實驗精密吸取對照品溶液5μl，連續進樣6次，測得峰面積響應值的RSD＝0.4％，表明系統精密度良好。

　　2.6  穩定性實驗取同一批樣品制得的供試品溶液，分別于0，2，4，6，8 h各進樣5μl，記錄色譜圖，測得峰面積響應值的RSD＝0.3％，可見供試品在8 h內穩定。

　　2.7  重復性實驗 同一批樣品，平行精密稱取6份，每份約0.8 g，按2.3方法制備供試品溶液，然后分別進樣5μl，測得平均含量為4.298 mg/g，RSD＝1.6％，表明該法重復性好。

　　2.8  加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的樣品（C11018）6份，分別置于具塞錐形瓶中，各精密加入對照品儲備液（0.185 mg/ml）1ml,按2.3方法制備供試品溶液，進樣測定。結果見表1。

　　a芍藥苷對照品色譜圖   b 溶液經前處理的色譜圖   c 溶液未經前處理的色譜圖

　　3  討論

　　3.1 樣品預處理和流出曲線的制備本品用稀乙醇作溶劑，大量的強極性大分子化合物被析出，將溶液直接照液相［3］，干擾組分太多，待測成分峰達不到基線分離，大量的基質對分析柱的損害大；溶液過固相萃取小柱時大量的基質被極性的氧化鋁填料吸附，從而有效地保護分析柱，待測成分也達到了良好的基線分離效果。由于氧化鋁對極性化合物的吸附力較強，因此，吸附在固相萃取小柱上的極性物質不易被溶劑洗脫下來，隨著溶液的繼續注入，固相萃取小柱對待測成分的吸附達到飽和狀態，此時流出液中待測成分的濃度與注入小柱前的待測成分的濃度一致。以1ml為單位，收集萃取小柱的流出液11ml，編號依次進樣測定，以流出體積為橫坐標，各流出液中芍藥苷峰面積與飽和流出段中芍藥苷平均峰面積的百分比為縱坐標，繪制流出曲線。結果見圖2。

　　從第8管（即第8毫升）起，固相小柱對芍藥苷的吸附已達到飽和狀態，為了保證實驗的準確度，收集第8～10毫升流出液作為供試品溶液。

　　3.2 填料的選擇實驗了酸性、堿性、中性3種氧化鋁作為柱填料，發現流出液中芍藥苷含量的變化趨勢無差別，但達到吸附飽和時芍藥苷的含量有差別，以中性氧化鋁為*，故作為本實驗萃取小柱填料。

　　3.3 溶液濃度與填料用量的關系實驗過程中我們發現溶液濃度與填料的用量成正比例關系，即溶液濃度低填料的用量少，濃度高填料用量多。但溶液濃度過高，待測成分提取不*；太低，溶液過萃取小柱的飽和段太窄，難以收集到準確的供試品溶液。本實驗選取了溶液濃度0.016g/ml與5.0 g中性氧化鋁填料的組成。